南方医科大学仁康医院消化肝病中心  吴邦富

(2010年12月)

人类感染乙型肝炎病毒（HBV）的慢性化与免疫系统对HBV发生免疫耐受有关，而产生免疫耐受的主要原因包括以下两个方面：①慢性HBV感染者的专职性抗原呈递细胞(APC)如树突状细胞(DC)、M1型巨噬细胞(MC或Mф)数量减少及功能低下，②慢性HBV感染者的T淋巴细胞亚群的数量、比例及功能失调。

一、抗HBV-DC治疗技术介绍：

现代免疫学研究显示，树突状细胞（dendritic cell, DC）是人体已知的功能最强的APC。它专职负责摄取、加工、处理及传递病原微生物及癌变细胞等非己抗原的信息给下一级免疫细胞，启动机体的抗感染及抗肿瘤免疫。

基础研究显示，慢性HBV感染者外周血中的DC数量减少，并且功能低下。慢性HBV感染者DC的功能低下主要是源于DC的不成熟状态：①低表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子；②低表达CD80、CD86等共刺激分子及细胞间粘附分子。DC数量的减少及功能低下，导致DC不能有效地将HBV感染的信息传递给T淋巴细胞，同时不能有效地为T淋巴细胞的活化提供第二信号(共刺激信号)，从而有效地活化原始T淋巴细胞，使免疫系统不能产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞和特异性的抗体来清除HBV。这是形成免疫耐受状态的主要原因。

通过体外细胞培养技术，可以获得大量活化、功能基本正常并携带有乙肝病毒抗原信息的DC。将其回输后可以使免疫系统重新恢复对乙肝病毒的免疫识别，完全(或部分)打破免疫耐受，重启抗乙肝病毒的免疫反应。

体外研究表明，以HBsAg或HBcAg致敏人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC，将该DC与T淋巴细胞共同孵育产生的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)显示出对转染HBV的肝癌细胞的特异性杀伤作用。

动物实验研究显示：给HBV转基因鼠输入体外激活的DC，不仅可以产生HBsAb，而且也产生HBsAg特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应。以HBsAg负载的DC过继免疫HBV转基因鼠，发现能够打破HBV转基因鼠对HBV的免疫耐受，诱发抗HBV的CTL反应，部分HBV转基因鼠的HBV-DNA、HBsAg及HBeAg转阴，HBsAb及HBeAb转阳。

人体临床试验表明：以HBsAg致敏慢性HBV感染者PBMC来源的自体DC，将该DC回输患者，显示能够抑制HBV的复制，部分患者的HBV-DNA、HBsAg及HBeAg转阴。

我们早期的临床研究显示，体外诱导扩增慢性HBV感染者自身PBMC来源的DC，并经HBsAg致敏后使其成为具有特异性治疗慢性HBV感染者的抗HBV-DC，将其静脉回输，可有效地抑制慢性HBV感染者的病毒复制，减少病毒载量，显著降低或清除病毒HBsAg和HBeAg，促进HBeAb的产生，促进HBeAg/HBeAb的血清学转换，部分慢性HBV感染者得到彻底治愈。慢性乙型肝炎患者、慢性HBV携带者和非活动性HBsAg携带者均可对抗HBV-DC的治疗发生良好的应答反应，是一种安全、有效的治疗慢性HBV感染者的免疫学治疗方法，显示出良好的应用前景。

我们的扩大临床研究显示，将抗HBV-DC回输治疗与核苷类似物和(或)胸腺肽a1等药物联合应用，发现可以进一步提高疗效，明显高于单纯药物治疗的疗效：

对于HBeAg阳性的慢性HBV感染者，治疗12周时：其中HBeAg阳性慢性HBV携带者中(即ALT正常)，HBV-DNA平均下降1.9 log，HBV-DNA阴转率为53.33%，HBeAg/HBeAb血清学转换率为15.39%。在HBeAg阳性的慢性乙肝患者中(即有ALT升高者)，HBV-DNA平均下降2.26 log，HBV-DNA阴转率为65%，HBeAg/HBeAb血清学转换率为45%，其中，ALT 1-2倍者的HBeAg/HBeAb血清学转换率为36.36%，ALT>2倍者的HBeAg/HBeAb血清学转换率55.56%，明显高于单纯药物治疗的HBeAg/HBeAb血清学转换率。

对于HBeAg阴性的慢性HBV感染者，治疗12周时：其中HBeAg阴性的慢性乙肝患者，HBV-DNA阴转率为100%，HBsAg平均下降81.66%，HBsAg转阴率(即彻底治愈率)为11.77%。在非活动性的HBsAg携带者中，HBsAg平均下降63.11%，HBsAg转阴率(即彻底治愈率)为30.77%，远远高于目前单纯药物治疗的效果。

二、抗HBV-MTL治疗技术介绍：

已知不同的蛋白或多肽抗原引起的免疫应答可分为T细胞依赖性和非T细胞依赖性。HBV的HBsAg是T细胞依赖性抗原，如果机体的T细胞功能低下，则不能产生有效的免疫应答，产生HBsAb；HBcAg既是T细胞依赖性抗原，又是非T细胞依赖性抗原，因此，即使机体的T细胞功能低下，也可产生HBcAb；HBeAg是T细胞依赖性抗原，需要T细胞的协助才能产生抗体，如果机体的T细胞功能低下，则不能产生HBeAb，但因其基因与HBcAg的基因有高度重叠，其细胞免疫应答与HBcAg的细胞免疫应答有交叉，使得HBeAg虽然较HBcAg不容易产生抗体，但较HBsAg更容易产生抗体。因此，只有当机体的T细胞功能有所好转时才会出现HBeAg/HBeAb的血清学转换，而要清除HBsAg并出现HBsAg/HBsAb的血清学转换有赖于T细胞功能的进一步改善或恢复。

人类的T淋巴细胞根据细胞表面分子、分泌细胞因子及功能的不同，可以将其分为多种类型(亚群)。目前研究较多并且对其功能有一定了解的T细胞类型主要包括以下几类：①细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，②辅助性T细胞(helper T cell, Th)，③自然杀伤T细胞(natural killer T cells, NKT)，④调节性T细胞(Treg)。

研究显示，慢性HBV感染者T淋巴细胞亚群的数量和比例失衡，以及T淋巴细胞亚群功能的缺陷是形成免疫耐受状态的另一主要原因。

(一) 细胞毒性T淋巴细胞与乙肝的慢性化

在HBV感染中，清除细胞内的乙肝病毒和造成肝细胞损伤主要是MHCⅠ类分子限制性的CD8⁺ T细胞，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。急性HBV感染可以激发强烈的、多克隆的特异性CTL反应，而在慢性HBV感染中，特异性CTL的数量较少，并且存在一定的功能缺陷，导致特异性CTL反应微弱，甚至缺失。

慢性HBV感染特异性CTL数量减少及功能缺陷的原因目前尚不完全清楚。专职性抗原呈递细胞(APC)中的DC和巨噬细胞(MC)的数量减少和功能低下，Th1/Th2类细胞比例和Th1/Th2类细胞因子的失衡，以及Treg数量增多和功能异常可能是主要原因。

(二) 辅助性T细胞与乙肝的慢性化

Th细胞(CD4⁺ T细胞)对机体的特异性和非特异性免疫均具有重要的调节作用，他能协助B细胞产生抗体, 也能促进其他T细胞的分化成熟，是一类重要的免疫调节细胞。据其分泌细胞因子的不同，可分为Th0、Th1、Th2和Th3 四个亚型。Th1、Th2和Th3细胞均由Th0分化而来。

Th0细胞：未接触抗原的T细胞被称为Th细胞前体，他们通过接触天然免疫细胞摄取的抗原而分化成一种不确定的状态，称为Th0细胞。Th0细胞既分泌Th1型细胞因子白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)，又分泌Th2型细胞因子IL-4, 可在不同信号的刺激下分化为Th1或Th2细胞。

Th1细胞：主要分泌IL-2、IFN-γ、IFN-α、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等。主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体生成，参与细胞免疫反应及迟发型超敏性炎症反应的发生，故称为炎症性T细胞，可被视为相当于迟发型超敏反应T细胞(TDTH细胞)。因而，Th1细胞在机体抗细胞内病原体感染中发挥重要作用。

Th2细胞：主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等。主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白G1(IgG1)和免疫球蛋白E(IgE)等抗体，与体液免疫反应有关。

Th3细胞：少数Th细胞被称为Th3细胞，他除分泌大量的IL-4和IL-10外，主要高表达TGF-β，但是不分泌IL-2和IFN-γ，可下调APC及Th1细胞的活性，起免疫抑制作用，所以，也有人将Th3细胞归类为调节性T细胞。

Th1和Th2细胞还分泌共同的细胞因子IL-3和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

机体正常时，Th1和Th2细胞功能处于动态平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。Th1和Th2细胞均从Th0细胞极化而来，当机体受到异己抗原攻击时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高, 另一亚群功能降低。

Th0细胞向Th1或Th2细胞的极化可受到局部的细胞因子浓度、免疫活性激素、抗原的类型和浓度、APC的类型及细胞受体与MHC亲和力的强弱等多种因素的影响。

1. 微环境中细胞因子的种类：是影响Th细胞分化的关键因素。①在诸多细胞因子中，IL-12和IL-4对Th0细胞选择性分化起关键性调节作用：在巨噬细胞所产生的IL-12作用下，诱导转录活化蛋白4激活, 有利于Th0细胞向Th1细胞分化；而在应答早期, 由NKT细胞和DC所产生的IL-4, 可促使Th0细胞分化为Th2细胞；如果环境中同时存在IL-4和IL-12，Th0细胞倾向于极化成Th2细胞。②IFN-γ能上调IL-12Rβ2的表达，在Th2细胞发育早期，IFN-γ可持续表达，使这些细胞仍保持对IL-12应答能力，克服IL-4对IL-12Rβ2表达的抑制作用。Th2细胞分化后, 因IFN-γ表达缺失，IL-4完全抑制了Th2细胞上IL-12Rβ2的表达，使之失去对IL-12的反应性。因此，短期培养中Th2细胞可逆转为Th1细胞，但长期培养后，或慢性疾病中的Th2细胞却不能逆转。③IL-18能与IL-12协作，通过激发IFN-γ表达与合成，促进Th1应答。④IL-13能与IL-4受体α2链结合，调节Th2分化。⑤IL-6能上调细胞因子信号抑制分子1(SOCS1)表达，而抑制Th1分化，同时促进、活化Th细胞分泌IL-4，诱导Th2分化。⑥TGF-β能激发IFN-γ表达与合成，促进Th1应答。

2. APC类型：是影响Th细胞分化的重要因素。①M1型巨噬细胞(MC或Mф)是IL-12的主要来源，因此当活化的M1型巨噬细胞为APC时，他能刺激Th0向Th1分化和激活。②B细胞提呈抗原则诱导Th2分化和激活。③NK细胞或受到抗原刺激后的成熟期DC产生IFN-γ和IL-12，IFN-γ和IL-12刺激Th1细胞产生IFN-γ，IFN-γ又上调多种细胞MHCⅠ类和MHCⅡ类分子的表达，从而加速抗原向T细胞的呈递。IFN-γ还诱导其他细胞分泌致炎性细胞因子和趋化因子，IFN-γ可以抑制IL-4的分泌，阻止Th0细胞向Th2细胞的极化，使Th0向Th1分化。④非专职的APC如肥大细胞、嗜酸性粒细胞等受到抗原刺激后产生大量IL-4和IL-10，抑制IFN-γ和IL-12的分泌，阻断Th0细胞向Th1细胞的极化，使Th0向Th2分化。⑤DC诱导Th细胞分化还与呈递的抗原本质和局部环境有关，如PGE2存在可以抑制DC细胞分泌IL-12，促使Th0细胞向Th2分化。在抗原呈递过程中, DC细胞和初始T细胞相互作用时DC细胞分泌IL-12的水平是决定DC细胞诱导T细胞分化方向的关键因素。

3. 抗原类型和浓度：对Th细胞的分化也有调控作用。①高剂量水溶性蛋白质抗原促进Th2细胞的形成，对Th1起抑制作用。②较低剂量的抗原和低亲和力的DC与Th细胞间相互作用有利于诱发Th2免疫反应。③超抗原TESS诱导Th2细胞分化。④纯蛋白衍生物(PPD)主要诱导Th1细胞分化。

4. 激素：对Th细胞的分化也有影响。①PGE2通过抑制Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)的产生，从而促进Th2型细胞因子(IL-4和I L- 5 )的产生。②糖皮质激素、孕酮、25(OH)D3促进Th2分化而抑制Th1应答。③雄激素、脱氢表雄甾酮可促进Th1分化。

Th1/Th2的不平衡可造成疾病的不同病理状态。在HBV感染中，如果Th1细胞亚群占优势，将促进细胞免疫反应，增强CD8+ T细胞(CTL)的活性，从而清除细胞内病毒，但同时增加了肝脏的炎症反应，从而加重肝细胞的损伤。如果Th2细胞占优势，将促进体液免疫反应，并抑制细胞免疫反应，CTL细胞活性减弱，肝细胞损伤减轻。

急性自限性乙肝患者常表现为强烈的、多克隆和特异性的CTL和Th1类细胞免疫反应。相反，在慢性HBV感染者中，细胞免疫反应很弱, 常不能检测到特异性的CTL和Th1类细胞免疫反应。

研究发现，慢性HBV感染者PBMC中Th0细胞占多数，而Th1、Th2总量和Th1/Th2的比值都是低下的。可能是由于病毒感染PBMC时对Th1和Th2细胞都产生直接或间接的破坏作用，其中Th1破坏多；也可能是由于DC和MC数量减少及功能缺陷，以及T细胞本身的功能缺陷，导致体内分泌的Th1类细胞因子不足，Th2细胞因子的表达占优势，造成Th1/Th2细胞因子失衡，使Th0不能向Th1分化。结果是Th1数量少，功能低下，使得机体的抗HBV细胞免疫反应缺失或不足，使HBV不能得到清除，导致感染的持续。

(三) 自然杀伤T细胞与乙肝的慢性化

NKT是一个具有自然杀伤细胞(NK)受体及功能的T细胞亚群，NKT活化时主要识别APC表面分化抗原CD1d分子提呈的糖脂类抗原，并在活化后释放高水平的IFN-γ和IL-4等，对于免疫应答的方向起着重要调节作用。并且NKT在肝脏优势聚集，占肝脏T淋巴细胞数的20%-30%，NKT在肝脏的局部免疫中有着重要地位。当HBV感染时, 肝脏内存在的大量NKT细胞一方面可以接受CD1d细胞提呈的HBV及亚病毒颗粒中的糖脂及磷脂等脂类抗原而活化；另外，在病毒诱导产生的细胞因子的作用下，NKT细胞可以间接地被活化。活化的NKT细胞通过分泌细胞因子和活化其他淋巴细胞来发挥抗HBV的作用。

NKT的功能有两种，一方面他有较弱的抗病毒及抗肿瘤的作用；更为重要的功能是其双向的免疫调节功能，使机体Th1与Th2处于相对平衡的状态，所以，也有学者将NKT归类为调节性T细胞。

急性自限性乙型肝炎外周血NKT含量明显高于健康对照组和慢性感染组，慢性乙型肝炎患者外周血NKT降低，并随肝损害程度加重而明显。原因可能与肝脏募集外周循环血液中的淋巴细胞有关，也可能是由于HBV直接作用于NKT，使之发生损伤或凋亡而减少。上述结果提示，慢性肝炎患者外周血NKT细胞降低可能与HBV感染后的慢性化有关。

(四) 调节性T细胞与乙肝的慢性化

调节性T细胞(Treg)是体内一个特殊的T细胞群体，它们对机体免疫平衡状态的维持起着重要作用，主要发挥免疫抑制效应。目前发现的具有免疫调节作用的Treg亚群主要包括：CD4+CD25+ Treg、Tr1型CD4+ Treg、Th3型CD4+Treg、CD8+抑制性T细胞(Ts)/Treg、CD8+CD28- Ts/Treg、NKT及CD3+CD4-CD8- Treg。

根据来源、特异性及效应机制，Treg可划分为天然性Treg和获得性Treg。CD4+CD25+ Treg属于前者，而Th3和Tr1属于后者。Treg对免疫的抑制作用有的是通过与效应细胞之间的相互接触方式(T-T接触)实现的，有的是通过分泌的细胞因子IL-10或TGF-β的作用实现的。

在众多关于Treg的研究中，对CD4+CD25+ Treg的研究最深入。研究显示，CD4+CD25+ Treg与人类感染HBV后的慢性化有关：慢性HBV感染者外周血的CD4+CD25+ Treg细胞数量显著高于正常人和急性自限性乙肝患者；慢性HBV感染者外周血的CD4+CD25+ Treg细胞数量与血清病毒载量呈正相关，并且HBeAg阳性慢性HBV感染者外周血的CD4+CD25+ Treg细胞数量明显高于HBeAg阴性者，同时肝脏中有大量的CD4+CD25+ Treg细胞浸润；在慢性HBV感染者的研究中发现，CD4+CD25+ Treg对HBV特异性CTL细胞和Th1细胞有明显地抑制作用。

慢性HBV感染者外周血Treg细胞数量升高的原因，可能与慢性HBV感染者专职性APC中DC及MC的数量减少及不成熟状态有关。因为不成熟的DC诱导初始性T细胞转化为Treg，而不是效应性CTL；成熟期DC及MC数量的减少，使得IL-12分泌减少，导致Th0向Th1极化减少，而使Th0向Th2和Th3分化增多，Th2和Th3分泌的IL-4和IL-10又可以诱导CD4+T淋巴细胞转化为Tr1和Th3类Treg。

通过体外细胞培养技术，可以获得大量含有下列细胞的具有抗HBV作用的MTL(抗HBV-MTL)：大量的HBV抗原特异性的CTL、较多的Th1细胞数量及较高的Th1/Th2细胞比例、较多的NKT细胞数量和较少的Treg细胞数量，另外还含有一定数量的成熟的APC(即抗HBV-MC和抗HBV-DC)。将这种抗HBV-MTL回输后可以使机体免疫系统的T细胞功能部分恢复或完全恢复，从而解除对免疫系统的免疫抑制，启动抗HBV的Th1型细胞免疫反应，打破免疫耐受，最终使HBV彻底清除。

联合抗HBV-MTL回输治疗可以较单纯抗HBV-DC回输治疗获得更好的临床治疗效果。

三、抗HBV-DC-MTL治疗技术的临床应用

(一)基本原理

通过体外细胞培养技术，可以获得大量活化的、功能基本正常并携带有乙肝病毒抗原信息的APC，即抗HBV-DC和抗HBV-MC。同时还可以获得含有大量的HBV抗原特异性的CTL、较多的Th1细胞数量及较高的Th1/Th2细胞比例、较多的NKT细胞数量和较少的Treg细胞数量并具有抗HBV作用的MTL(抗HBV-MTL)。将这种抗HBV-DC、抗HBV-MC及抗HBV-MTL回输后，可以使机体免疫系统重新恢复对HBV的免疫识别，同时使机体的T细胞功能得到改善或恢复，解除对免疫系统的免疫抑制，打破免疫耐受，重启抗乙肝病毒的免疫反应，使HBV最终得到彻底清除。对病毒复制活跃者联合抗病毒药物可以取得更好的治疗效果。

(二)临床应用方法

取患者肝素抗凝的外周静脉血50毫升，以密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMC)，再以贴壁法获得PBMC中的干细胞和单核细胞，以及悬浮的淋巴细胞。贴壁细胞在37℃和5%CO2浓度的条件下，经多种细胞因子分别诱导扩增出DC和MC；悬浮细胞经多种细胞因子培养成MTL。第5-6天给予HBsAg致敏DC和MC，使其成为具有特异性抗HBV的DC(即抗HBV-DC)及MC(即抗HBV-MC)。第7天将收获的DC加入2毫升生理盐水中，皮下和静脉各1毫升注射给患者；将同时收获的抗HBV-MC加入MTL培养体系，在多种细胞因子的作用下，继续诱导培养成具有抗HBV作用的MTL(抗HBV-MTL)。第14天将收获的抗HBV-MTL加入2毫升生理盐水中，静脉注射给患者。

治疗过程按阶段(疗程)实施：

第一阶段(疗程)：约1个半月，抗HBV-DC及抗HBV-MTL回输治疗均为每2周1次，各回输两次。第二次回输后间隔两周复查，评估治疗效果。无效者停止治疗；治疗效果良好，但还未能达到治疗终点者继续第二阶段(疗程)的治疗；效果好并达到治疗终点者需完成下一阶段(疗程)的巩固治疗。

第二阶段(疗程)：约2个半月，抗HBV-DC及抗HBV-MTL回输每4周1次，各回输2次后间隔两周复查，评估治疗效果。治疗效果良好，但还未达到治疗终点者继续第三阶段(疗程)的治疗；效果好并达到治疗终点者需完成下一阶段(疗程)的巩固治疗。

第三阶段(疗程)、第四阶段(疗程)和第五阶段(疗程)：各阶段(疗程)均大约3个月，抗HBV-DC及抗HBV-MTL回输每4周1次，各回输3次后间隔两周复查，评估治疗效果。治疗效果良好，但还未达到治疗终点者继续下一阶段(疗程)的治疗；效果好并达到治疗终点者需完成下一阶段(疗程)的巩固治疗。

完成五个阶段(疗程)的治疗后(约13个月，各回输13次)，如果还未达到治疗终点，视患者的具体情况确定是否继续治疗。如果效果良好，可以进入下一阶段(疗程)的治疗，否则应终止治疗。不推荐超过2年时间的生物免疫治疗。

从第二阶段(疗程)开始，如果患者经济上能够承受，也可以继续维持每2周1次的治疗间隔，这样可以提高疗效。

对病毒复制活跃者，建议联合使用核苷类抗病毒药物或干扰素治疗，这样可以提高疗效。

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