北京大学第一医院

张恒辉　何豫　赵鸿　朴文花　刘茂昌　席宏丽　于敏　王贵强

目前认为，HBV慢性感染的主要原因是针对HBV特异性细胞免疫功能的低下。DC是功能最强大的抗原递呈细胞，在病毒抗原摄取、递呈及特异性免疫激活中均具有重要作用，是抗感染免疫的中心环节，而近年来研究发现慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B，CHB)的树突状细胞存在成熟及功能的异常，导致其激活特异性抗病毒免疫反应特别是细胞免疫反应的能力低下。因此，恢复CHB患者DC的功能，增强其激活特异性抗HBV病毒免疫的能力，则可能起到打破免疫耐受，彻底清除病毒的作用，有助于CHB治疗。

本研究通过在体外进行CHB患者单核细胞树突状细胞方向转化，并辅以聚肌胞poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能，活化病人自身的T淋巴细胞，以获得数量更多、功能更强的HBV特异性的CTL，并通过最近开展的Elispot法及我们自己构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。

1．材料和方法

1.1．研究对象：选择北京大学第一医院门诊和病房2004年5月至2004年9月收治的12例CHB患者，诊断符合按2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案》(2000年9月，西安)。患者年龄22～52岁，全部病人均经ELISA方法检测HBV血清学标志：HBsAg、HBeAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，并用荧光定量PCR方法检测HBV DNA水平。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。所有研究对象均无心脑肾及其他器官合并症。

1.2．主要试剂与仪器：重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)和重组人白细胞介素4(rh-IL-4)由厦门特宝公司馈赠。FITC或PE标记的抗人CD14，CD83、CD86、CD80、HLA-DR、CD3标记抗体购于英国Caltag公司产品。AIM-V培养基购于GIBCO公司，Ficoll-Hypaque淋巴细胞分层液购于Amersham Biosciences公司。聚肌胞(Poly I:C)为北京永康制药厂产品，批号20020227。IFN-γ Elispot试剂盒购于美国BD公司。HBV core 18～27肽四聚体(PE-conjugated HLA-0201/HBV core 18～27 tetramer)本研究室构建。流式细胞仪(Flow cytometry，Becton Dickinson FACScan)。CTL IMMUNOSPOT 分析仪(Immunospot Analyzer，Cellular Technology Ltd)。

1.3．HLA-A2型别鉴定：取100μl全血与100μl鼠抗人HLA-A2单抗室温共孵育15min，加入2ml红细胞裂解液裂解红细胞，PBS 洗1遍，加1μl羊抗鼠IgG-FITC，室温避光反应15min，2ml PBS 洗3遍。最后用1%多聚甲醛300μl重悬固定，行流式细胞仪检测。同时每份标本均设自身阴性对照。

1.4．树突状细胞的体外培养扩增及鉴定：静脉抽取外周血20ml/人，EDTA-K3抗凝。利用Ficoll-Hypaque分离PBMC以完全的RPMI 1640悬浮细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，加入24孔培养板中每孔0.5ml，37℃ 5% CO2孵箱培养2h，使其中的单核细胞贴壁，用温热的无血清的RPMI 1640液轻轻洗培养板以去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞，参照Romani N的方法，在培养板中加入含rh GM-CSF1000IU/ml、rh-IL-4 800IU/ml的AIM-V培养基，置于37℃ 5% CO2 孵箱中，隔天半量更换培养液。培养第7天，每孔加入0～500mg/ml Poly I：C，间隔浓度为75μg/ml，以不加Poly I：C的作为对照，共培养9～10天，收集悬浮细胞。收集的细胞通过光镜的观察形态学、电镜观察超微结构，以及通过流式细胞仪对HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子的检测，对所获得DC进行功能及成熟度的鉴定。

1.5．以DC为APC体外诱导病毒抗原特异性T细胞；DC培养第9天，加入HBV 核心肽(HBV core 18～27 FLPSDFFPSV)终浓度10μg/ml，作用120min后，加入含50μg/ml丝裂霉素C(MMC)37℃作用45min，用培养基充分清洗3次，以去除残留的MMC，加入96孔圆底培养板，细胞数为1×104/孔，加入经尼龙毛柱分离的自体T细胞，细胞数1×105/孔，24h后加入IL-2 30U/ml，隔天半量更换培养基，继续培养48～72h，收获细胞并计数，测定其功能。以T细胞单纯IL-2维持组作为阴性对照。

1.6．Elispot检测T细胞分泌IFN-γ的T细胞频数：采用BD公司IFN-γ Elispot检测试剂盒。将96孔平底PVDF板，每孔加入抗人IFN-γ的捕获抗体100μl，封板，4℃过夜。第2天，用PBS缓冲洗洗板3次，每孔100μl加入完全RPMI-1640培养液封闭2h后，洗板，加入T细胞，细胞数1×105/孔，37℃，5% CO2条件下孵育15～20h。20μg/ml刀豆蛋白A(ConA)刺激组为阳性对照。弃细胞，加入100μl/孔，01% Tween 20 PBS缓冲液，4℃静置10min，洗板3次，加入生物素标记抗人IFN-γ二抗，37℃放置1.5h，洗板后，加入藻红蛋白标记抗生蛋白链菌素作用1h，洗板4次，加入AEC底物液，作用5～20min，肉眼观察显色情况，用蒸馏水冲洗，终止反应。待反应板晾干后，CTL IMMUNOSPOT分析仪计数每孔斑点数，求出两复孔的平均值。以经DC作用后的T细胞组斑点数减去单纯的IL-2维持组斑点数即为病毒特异性的T细胞频数。

1.7．四聚体标记与流式检测：用PBS调节T细胞的数量为4×105/管，加入1μl FITC标记的抗CD8抗体，避光，室温反应15min，用PBS洗涤细胞两次与2μl四聚体于室温避光反应15min，用BPS洗两遍。300μl 1%多聚甲醛重悬固定，行流式检测。每例患者标本均设各自同型对照。对于乙肝患者，采用HLA-A0201/HCV 四聚体标记作为阴性对照。

1.8．统计学分析：用SPSS10.0软件进行统计分析。实验数据以±SD表示，组间比较用配伍组方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2．结果

2.1．树突状细胞的扩增、表型鉴定及Poly I:C对其表面分子表达的影响：培养第10天收集悬浮的细胞，流式检测HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD11c、CD3、CD14的表达情况，并观察不同浓度Poly I:C作用对DC的影响，发现75ug/ml的作用浓度为最适合浓度，浓度太低无明显效果，太高则DC的生长受到影响。检测发现与未加入Poly I:C组比较，经Poly I:C作用后，CHB患者DC表达的CD80、CD86、CD83、CD11c的阳性率均明显上调，而CD14的阳性率下降。其中刺激前后CD80、CD83、CD14相差均有显著性(P＜0.001)。

2.2．Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-γ的CTL细胞频数的比较：以CHB患者体外诱导转化的DC作为抗原呈递细胞，将其与自体T细胞共同孵育，以Elispot检测病毒抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞的频数。病人自身维持生长的T淋巴细胞中分泌IFN-γ的CTL细胞频数的均值为17(每1×105个细胞)，经自身DC刺激后T淋巴细胞中分泌IFN-γ的CTL细胞频数的均值上升为45，与自身维持生长的T淋巴细胞相比差异有显著性(P＜0.001)；DC经Poly I:C作用后，活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高，均值为99，与自身维持生长的T细胞组及自身的DC刺激组相比，差异均有显著性(P＜0.001)。

2.3．Tetramer流式细胞技术检测HBV core 18～27特异性CD8+ T细胞结果：将病人自身T淋巴细胞、自身DC活化的T淋巴细胞以及Poly I:C刺激的DC活化的T淋巴细胞通过Tetramer流式细胞技术检测HBV core 18～27特异性CD8＋ T细胞的频数，12例HLA-A2+的CHB患者的自身T细胞组特异性CTL的频数为0.43%～1.74%，均值为0.72；经自身DC活化后的特异性CTL的频数上升至0.78%～2.65%，均值为186，与自身T细胞组经配对t检验比较差异有显著性(P＝0.007)；经Poly(I:C)刺激的DC活化后，特异性CTL的频数显著上升至1.16%～460%，均值为3.10，与自身维持生长的T细胞组及自身DC刺激组相比，差异均有显著性(P值均小于0.0001)。

3．讨论

HBV急性感染时，患者体内可检测到多克隆、高反应性的病毒特异性CTL，可迅速、彻底清除病毒。而在HBV慢性感染中，却只能测到单一克隆、弱反应性的病毒特异性CTL。机体处于对HBV的免疫耐受状态则是乙型肝炎慢性化、迁延不愈的重要原因。过去的研究表明，与健康人相比，CHB患者的DC数量减少、表型及功能低下，不能有效地激活对病毒的免疫反应，导致免疫耐受。改善CHB患者DC的功能，恢复甚至增强其诱导、活化病毒特异性CTL的能力，诱导出类似急性感染时机体多克隆、高反应性的病毒特异性CTL，很有可能打破免疫耐受，达到治疗、治愈CHB的目的。

我们的实验证明，通过用GM-CSF和IL-4诱导CHB患者PBMC中的单核巨噬细胞在体外培养中转化成DC，负载HBV特异多肽多，与患者自身的T淋巴细胞共作用。经Elispot和tetramer检测，与未刺激前相比，分泌IFN-γ的CTL细胞频数均值由17上升为45，约为2.64倍，差异有显著性(P＜0.001)；HBV core 18～27表位特异的频数均值由072%上升至1.86%，提高约2.6倍，差异有显著性(P＜0.001)。数据表明培养的DC能够诱导出高频数及功能较强的病毒特异性CTL。

聚肌胞poly(I:C)是一种强的Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(IFN-α/β)诱生剂。在临床上与利巴韦林等抗病毒药联合应用治疗病毒性感染疾病。曾应用于治疗慢性乙型病毒性肝为，有一定的抗病毒效果。前人研究发现Poly(I:C)能够有效的诱导体外单核细胞转化的DC成熟，并维持DC的成熟状态。我们用无血清AIM-V培养基体外培养CHB患者PBMC转化为DC，对其进行形态、表型、功能鉴定，并用Poly(I:C)作用DC，观察poly(I:C)对DC的影响。发现未经poly(I:C)作用时，CHB病人树突状细胞CD80、CD83的表达显著低于正常人，CD14的表达显著高于正常人。CD83是DC成熟的重要标志，而且在行使DC的功能时具有重要作用，病毒感染能下调CD83的表达，从而抑制机体产生的抗病毒免疫反应，而CD14则是单核细胞的特异性分子标记。这提示在poly(I:C)作用下，慢性乙型肝炎病人单核细胞向DC的转化能力高于poly(I:C)未作用组，Poly(I:C)对慢性乙型肝炎体外转化培养的DC有显著的促成熟作用。通过检测与DC共作用的T细胞，我们发现经Poly(I:C)作用后的DC所活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高，均值为99，未刺激组和自身DC刺激组比较分别升高58和22倍；差异均有显著性(P＜0001)；而经Poly(I:C)刺激的DC活化后，HBV core 18～27表位特异性CTL的频数均值上升为310；分别为前2组的43和17倍，差异均有显著性(P值均小于00001)。说明通过在DC培养的过程中加入聚肌胞不仅可获得成熟度更好，抗原递呈功能更强的DC，还可显著增强DC体外诱发高频数及功能强的病毒特异性CTL的反应。

近年发展起来的Elispot技术检测活化的分泌IFN-γ的有功能的病毒特异性T细胞；HLA-A2肽四聚体复合物检测法检测HBV core 18～27特异性CTL的数量，具有高敏感性和高特异性。通过对这两种技术的应用，能够更准确、客观的评价我们体外转化DC并活化特异性T淋巴细胞的能力。我们的研究发现：CHB患者体外单核细胞转化的DC对自身T细胞的活化可显著提高病人体内病毒特异性CTL的数目，并增强病人T细胞分泌IFN-γ的能力；在DC培养中加入Poly(I：C)，能显著增强DC功能，获得数量更多、功能更强的病毒特异性CTL。这些结果和新的检测方法的采用，对于我们开展CHB的DC免疫过继治疗以及对治疗效果的评价提供了更为有利的实验基础。