郭建巍 秦力维 蔡美英 郭元彪 吕同德于兰

中华肝脏病杂志，2003年第11卷第7期：414

肝癌患者体内的树突状细胞（DC）负载肝癌相关抗原，诱导机体产生有效的免疫应答，是肝癌治疗的一条有效途径。

1. 材料与方法：(1)主要材料：人类白细胞抗原（HLA）-DR、异硫氰酸荧光素标记（FITC）单克隆抗体（美国Pharmingen公司），CD3、CD4、CD8三色荧光标记单克隆抗体，γδT细胞FITC标记单克隆抗体；牛分枝杆菌卡介苗-热休克蛋白70（BCG HSP70）由本研究室纯化制备，人γ干扰素 mRNA原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）；白细胞介素12（IL-12）P70酶联链疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（美国Biotech公司），兔抗人FasL多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；18～25岁健康志愿者；各种实验用细胞均为本研究室液氮保存。Elite-ESP型流式细胞检测仪（美国Beckman Coulter公司）。(2)方法：癌细胞表面HLA-DR的表达参见文献[1]。DC的体外诱导鉴定与肝癌细胞可溶性抗原的制备参见文献[2]。肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞培养上清液中肿瘤坏死因子（TNF）检测用四甲基偶氮唑蓝法, IL-12检测用ELISA试剂盒按说明书进行。将负载肝癌抗原DC、负载肝癌抗原后经BCG HSP 70活化的DC分别与自身淋巴细胞以1:5混合，用含300U/ml基因重组IL-2的完全RPMI 1640分瓶培养，第7天流式细胞术检测淋巴细胞表面CD56、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+ T细胞比例、γδT细胞表面特异性分子的表达。原位杂交检测淋巴细胞内γ干扰素mRNA表达。流式细胞术检测经DC活化后淋巴细胞表面FasL表达。肝癌DC疫苗活化细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肝癌细胞的特异性杀伤参见文献[3]。统计学处理用χ2检验。

2. 结果：SMMC-7721细胞HLA-DR抗原表达率高达99.3%，QGY-7703细胞表达率仅为2.9%，而Alexander细胞表达率为82.6%。将DC、负载肝癌可溶性抗原的DC及BCG HSP 70活化、负载肝癌抗原的DC与自身淋巴细胞共同培养后，淋巴细胞表面CD56分子表达下降，CD3+/CD4+和CD3+/CD8+ T细胞比例增加，CD4/CD8比例由诱导前的0.84增加为1.04和1.11。负载肝癌可溶性抗原的DC与自身淋巴细胞共同培养后，γδT比例没有改变，而BCG HSP 70活化的、负载肝癌抗原的DC与自身淋巴细胞共同培养后，γδT比例减少为22.3%。TNF对L929细胞的死亡率分别为25.2%和20.0%，而IL-2条件下培养的自身淋巴细胞培养上清液中未测出TNF；经DC和DC负载肝癌可溶性抗原后活化的淋巴细胞培养上清液中IL-12水平分别为23.4pg/ml和27.3pg/ml。活化后淋巴细胞γ干扰素mRNA的表达均达95.0%以上，与未活化细胞有明显区别（χ2＝4.20，P<0.05）。BCG HSP70活化的DC作用前后淋巴细胞表面FasL表达率分别为5.9%和16.0%。肝癌DC疫苗活化CTL对各种肝癌细胞均有不同程度的杀伤作用，杀伤效果明显高于非特异性淋巴细胞。

3. 讨论：DC疫苗活化后自然杀伤细胞特异性标志CD56分子表达减少，CD4+、CD8+ T细胞数量增加，其中以CD4+增加最为明显，由诱导前的0.84增加为1.11，而广泛参与机体抵抗外来病原体感染、介导转移性肝癌非依赖性细胞毒的TCRγδ＋T细胞比例减少，说明活化的细胞主要为CD4+ T细胞同时还有部分CD8+ T细胞，活化细胞培养上清液和细胞中可分别检测到Th1型细胞因子TNF和γ干扰素mRNA。虽然DC负载肝癌可溶性抗原后，10.1% DC细胞失去了其特征，同时其表面CD54、CD83、CD86分子表达下降。但BCG HSP70的活化有利于负载肝癌可溶性抗原的DC维持其特异性标志，使其表面CD54、CD83、CD86分子的表达增加，DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力增强，淋巴细胞增殖加快，从而促进DC成熟，增加其抗原呈递能力。DC疫苗活化的CTL不但可以杀伤与负载抗原相同的靶细胞，同时还可不同程度的杀伤其它肝癌细胞。

参考文献

[1]郭建巍, 蔡美英, 魏大鹏, 等. 树突状细胞负载甲胎蛋白、细胞毒性T细胞表位肽后的免疫应答. 中华肝脏病杂志, 2002, 10: 178-180.

[2]郭建巍, 蔡美英. 人外周血中树突状细胞的诱导和鉴定. 华西医科大学学报, 2002, 33: 68-71.

[3]郭建巍, 蔡美英. 树突状细胞负载肝癌可容性抗原后的免疫应答. 免疫学杂志, 2002, 18: 123-127. 

    作者单位：730050 兰州军区兰州总医院实验科（郭建巍、吕同德、于兰），眼科（秦力维）；成都，四川大学华西基础医学与法医学院免疫教研室（蔡美英、郭元彪）